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蘆薈超氧化物歧化酶(SOD)實驗室提取工藝

[日期:2011-09-14] 來源:  作者:西貝生物 [字體: ]

    一、原料處理(從大棚采集到處理最好小于五小時)
    蘆薈鮮葉→自然水清洗→消毒→無離子水洗凈(三次)
    二、取原料
    可單取凝膠或取整葉、稱量。
    三、將原料入組織搗碎勻漿(加入2倍休積50m mol/ι)的磷酸鉀緩沖液PH7.8,內含0.1%B—巰基乙醇,1m mol的EDTA,笨甲酸鈉小許0.4克/100ml,再加50克/1000ml的PVP→4℃攪拌浸提1~2h,→八層紗布過濾,→濾液離心(4000r/min—8000r/min,20min,4℃)→上清液過濾(量出體積,留小樣跟綜測試用)。
注:若酶活較低,可考慮在提取液中加入20~30%V/L的甘油保護)
    四、沉淀
    加硫酸銨于上清液中,使之達40%飽和度,→放置30min(4℃)離心(4000r/min—8000r/min,20min,4℃)→上清液留小樣作跟綜測試,上清液再加(NH4)2SO4,使之分別達60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%,4℃靜止2h,以8500r/min、20min,4℃分別離心,收集沉淀,將沉淀 用2.5m mol/l的磷酸鉀緩沖液1~2倍體積重溶(PH7.8),分別測定SOD、CAT酶活,合并酶活測定時較大部分,確定(NH4)2SO4分級沉淀條件,(留小樣作跟綜測試用)。
注:重溶時不溶物為變性蛋白、離心除去。
    五、透析
    重溶酶液裝透析袋,用2.5m mol/l的緩沖液透析,每天換水2次,兩天后用5%  Bacl2檢測透析袋至無白色沉淀止,透析完畢,將酶液在4000r/min離心min,(20min,4℃),所得上清液即為超氧化物岐化酶(SOD)粗品。

    六、粗品提純
    可延用經典方法。

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